在科研的微观世界里，人血管内皮因子（VEGF）试剂盒（ELISA）就像一位超厉害的 “微观密探”，专门负责破解人血管内皮因子的浓度之谜。

一、试剂盒大揭秘

试剂盒有 48T 和 96T 两种规格，保质期 6 个月，要在 2 - 8℃的 “小冰箱” 里好好保存。它的检测范围在 62.5 - 2000pg/mL，灵敏度小于 10pg/mL，就像有一双超敏锐的 “眼睛”，能精准探测到极微量的 VEGF。而且它还很 “专一”，对结构类似物不理不睬，没有交叉反应。重复性也很棒，板内变异系数小于 10%，板间变异系数小于 15%。记住，它可是科研专用，不能用于临床诊断哦。

二、实验原理大起底

实验开始前，抗人 VEGF 抗体早已在微孔酶标板这个 “秘密基地” 设下埋伏。当我们加入 VEGF 校准品和待测样本时，VEGF 就像 “小目标”，一头扎进抗体的 “陷阱”，与之结合。接着，HRP 标记的抗人 VEGF 抗体也来 “凑热闹”，三者形成了稳固的 “夹心复合物”。经过一番温育和充分洗涤，把那些游离的 “小喽啰” 都清理出去。然后加入底物 A 和 B，在 HRP 这位神奇 “魔法师” 的催化下，底物从无色摇身一变成为蓝色，再加入终止液（2M 硫酸），瞬间变成黄色。而且颜色越深，说明 VEGF 越多。最后，酶标仪这位 “数据大师” 在 450nm 波长下测定吸光度（OD 值），我们就能算出 VEGF 的浓度啦。

三、实验前准备

1. “唤醒” 试剂盒和样本：提前 2 小时，把试剂盒和样本从冰箱这个 “冰窖” 里解救出来，让它们在室温下尽情 “撒欢”，充分适应环境。
2. 洗涤液准备：从冰箱拿出的浓缩洗涤液要是有结晶，别担心，这就像冬天湖面结冰，是正常现象。把它放在温水里泡一泡，等结晶融化后，按 1:20 的比例，用蒸馏水稀释，即 1 份浓缩洗涤液搭配 19 份蒸馏水。
3. 底物准备：底物液 A 和 B 在使用前，按 1:1 的体积充分混合，而且要在 15 分钟内用完，不然它就 “罢工” 啦。

四、实验必备物品

1. 酶标仪（450nm），堪称 “数据大师”，精准收集关键数据。
2. 精密移液器及一次性吸头，它们是加样的 “神枪手”，保证每一次加样都精准无误。
3. 蒸馏水，实验中的 “小助手”。
4. 洗瓶或者自动洗板机，负责清洗的 “小卫士”。
5. 37℃水浴锅或恒温箱，给实验提供温暖的 “小窝”。
6. 500ml 量筒，量取液体的 “小量具”。

五、样品收集与储存

1. 细胞培养上清：在 4000rpm 的转速下离心 20min，去掉细胞颗粒和聚合物这些 “小麻烦”，上清液放在 - 20℃以下的 “大冷库” 里保存，千万别反复冻融。
2. 血清：用不含热原和内毒素的试管收集血液，操作时别刺激细胞，然后在 4000rpm 的转速下离心 20min，小心分离出血清，存放在 - 20℃以下的 “大冷库”，避免反复冻融。
3. 血浆：用肝素、EDTA 或柠檬酸钠抗凝，在 4000rpm 的转速下离心 20min 取上清，放在 - 20℃以下的 “大冷库”，防止反复冻融。
4. 组织匀浆：用预冷的 PBS 给组织洗个 “冷水澡”，去掉残留血液，称好重量后把组织剪碎。按照 1:9 的比例，把剪碎的组织和 PBS（加点蛋白酶抑制剂这个 “小帮手”）放到玻璃匀浆器里，在冰上使劲磨。要是想让组织细胞碎得更彻底，还可以对匀浆液进行超声破碎或者反复冻融。最后在 5000×g 的转速下离心 5 - 10 分钟，取上清检测。
5. 细胞提取液：贴壁细胞先用冷的 PBS 轻轻洗个澡，再用胰蛋白酶消化，然后在 1000×g 的转速下离心 5 分钟收集细胞；悬浮细胞直接离心收集就行。收集到的细胞用冷的 PBS 洗 3 次澡，每 1×106 个细胞加 150 - 200μL PBS 重新悬浮起来，通过反复冻融让细胞 “散架”（要是含量少，PBS 可以少加点）。在 1500×g 的转速下离心 10 分钟，取上清检测。
6. 其他生物体液：在 1000×g 的转速下离心 20 分钟，去除杂质及细胞碎片这些 “小麻烦”，取上清检测。

六、操作步骤

1. 准备工作液：按说明书的方法，把试剂盒各种组分的工作液都配制好。
2. 取出板条：从铝箔袋中拿出所需板条，剩下的用自封袋密封好，放回冰箱。
3. 设置孔位：设置标准品孔、0 值孔、空白孔和样本孔。标准品孔各加不同浓度的标准品 50μL，0 值孔加样本稀释液 50μL，空白孔啥也不加，样本孔加待测样本 50μL。
4. 加入检测抗体：除空白孔外，标准品孔、0 值孔和样本孔都加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体 100μL。
5. 温育反应：用封板膜把反应板盖住，在 37℃水浴锅或恒温箱里避光孵育 60min。
6. 洗板环节：揭开封板膜，把液体倒掉，在吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置 20S，再把洗涤液甩出去，在吸水纸上拍干，如此重复 5 次。要是用自动洗板机，按操作程序洗板，别忘了加个 30s 浸泡的步骤，能提高检测精度哦。洗板结束，加底物前，要在干净不掉屑的纸上把反应板充分拍干。
7. 加入底物：将底物 A 和 B 按 1:1 的体积充分混合，在所有孔中加入底物混合液 100μL。用封板膜盖住反应板，在 37℃水浴锅或恒温箱里避光孵育 15min。
8. 加入终止液并读数：所有孔加入终止液 50μL，在酶标仪 450nm 波长上读取各孔吸光度（OD 值）。

七、结果计算

1. 绘制标准曲线：以标准品浓度为横坐标（6 个标准品孔加 1 个 0 值孔，共 7 个浓度点），对应的吸光度（OD 值）为纵坐标，用计算机软件，采用四参数 Logistic 曲线拟合（4 - pl），创建标准曲线方程。
2. 计算浓度：通过样本的吸光度（OD 值），利用方程算出样品的浓度值。要是样品被稀释过，得把算出来的浓度值乘以稀释倍数，这才是样品的最终浓度。

八、注意事项

1. 试剂盒使用：只能在有效期内使用，不能和其他厂家的试剂盒或组分混用，要用配套的样品稀释液。
2. 实验操作：混合蛋白溶液时别起泡，加校准品与样本时要换移液枪头，公共组分悬臂加样，避免交叉污染。保证合适的温育时间和充分的洗涤步骤，这可是实验结果准确的关键。用自动洗板机时，加个 30 秒浸泡步骤。底物溶液要是变成蓝色，就失效不能用了。终止液加样顺序和底物溶液一致，加了终止液，蓝色底物产物会瞬间变黄。实验中用剩的板条，要马上放回自封袋，密封（低温干燥）保存。所有液体组分，使用前要充分摇匀，严格按说明书标明的时间、加样量及加样顺序进行温育操作。
3. 生物安全：检测要符合实验室管理规范，防止交叉污染，所有样品、洗弃液和废弃物都要按传染物处理。试剂盒的液体组分含有 proclin - 300 防腐剂，可能引起皮肤过敏，别吸入烟雾，也别让它接触皮肤。底物液对皮肤、眼睛和上呼吸道有刺激，同样要避免吸入烟雾。做实验时记得戴上防护手套，做完彻底洗手。